摘要

人畜共患線蟲callipaeda感染家畜和野生動物的眼睛，并以犬科動物為主要宿主。它最初是在亞洲被描述的，但在過去的20年里，它在許多歐洲國家都有報道，主要是由果蠅傳播的。本文報道了在奧地利發(fā)生的callipaeda及其病媒p.a variegata。從臨床病例中采集線蟲，用誘捕器、網(wǎng)和從一只狗的結(jié)膜囊中捕獲果蠅。對果蠅和線蟲進行了形態(tài)學鑒定，并分析了線粒體細胞色素c氧化酶亞基I基因(COI)的一個片段。計算DNA單倍型網(wǎng)絡(luò)，可視化獲得的COI序列與已發(fā)表序列的關(guān)系。此外，采用聚合酶鏈反應法對花椒屬植物進行了DNA篩選。callipaeda和P. variegata分別在Burgenland、Lower Austria和Styria被鑒定。在維也納也有記載，在意大利上奧地利州和南蒂羅爾也有記載。所有callipaeda均為1型單倍型。在果蠅中鑒定出22種不同的單倍型。其中一個序列與雜色花木的序列明顯不同，與chi花木和okadai花木的序列關(guān)系更為密切。在所有植物標本中均未檢出callipaeda。

圖形抽象

背景

callipaeda是一種螺旋體目的寄生線蟲，影響各種哺乳動物的眼睛，由果蠅Phortica variegata傳播。在家養(yǎng)動物中，狗(Canis lupus familiaris)經(jīng)常受到感染，但貓(Felis silvestris catus)和兔(Oryctolagus cuniculus)也有感染的報道[1,2,3,4]。由于人類也可被感染，但頻率較低，因此，毛足絳蟲也是一種人畜共患線蟲，因此對公共衛(wèi)生具有重要意義[5,6]。在野生動物中，已在犬科、狐科、熊科、鼬科、原猴科、狐科和狐科中發(fā)現(xiàn)了callipaeda，它們代表了許多可能的潛在宿主[7,8,9,10,11,12]。

感染callipaeda的臨床癥狀差異很大，可分為四個階段，從無臨床癥狀到角膜潰瘍[3]。callipaeda通常在眼瞼和眨眼膜下發(fā)現(xiàn)，很容易與其他影響眼睛的線蟲區(qū)分開來，如盤尾絲蟲lupi，它嵌入眼睛周圍組織，通常與結(jié)節(jié)形成有關(guān)[13]。結(jié)合從眼睛中去除線蟲，大環(huán)內(nèi)酯，如莫西丁素和米霉素肟，對于預防感染和治療都是有用的[14,15,16,17]。

由于其最初分布在亞洲，因此也被稱為“東方眼蟲”。在歐洲，已在大多數(shù)南部和中部國家發(fā)現(xiàn)了T. callipaeda，預計將在整個歐洲大陸進一步傳播[18,19,20]。細胞色素c氧化酶亞基I基因(COI)的一個片段是常用的DNA條形碼區(qū)域，該區(qū)域可用于T. callipaeda的分子鑒定和不同單倍型的區(qū)分。在T. callipaeda的歐洲種群中，僅檢測到一種單倍型，而亞洲種群具有高度多樣性，已知有20多種不同的單倍型[21,22]。

金毛蠅的有性繁殖發(fā)生在哺乳動物中，哺乳動物是最終宿主，而Phortica屬的親動物果蠅是中間宿主。雄性Phortica以淚液為食，在攝食過程中吞食T. callipaeda的一期幼蟲[22]。在中間寄主中，幼蟲可存活147天，發(fā)育為第三期幼蟲，當果蠅下一次以淚液為食時，幼蟲可傳播給新的最終寄主[23]。

在歐洲，斑葉絳蟲的主要媒介是斑葉絳蟲，而在亞洲則是岡田絳蟲[22]。在實驗室條件下，老登白刺也是一種有能力的病媒，但其在野外條件下的病媒能力需要評估[24]。解剖法和聚合酶鏈反應法(PCR)可以檢測白背蛾幼蟲;然而，活體果蠅是通過解剖檢測線蟲的必要條件[25,26]。

為了收集斑葉蠅，捕蠅器可以手工制作，成本低，容易獲得的組件?；蛘?，在人或狗的眼睛周圍放置網(wǎng)也可以用于此目的。雖然與捕蠅器相比，這是一種耗時且效率較低的方法，但使用這種方法可以收集到更多的雄性標本[27]。鑒定可以通過形態(tài)學特征或分析COI條形碼區(qū)域來完成[28,29,30,31]。

歐洲大部分地區(qū)，特別是中歐，都有海拔米的山區(qū)，適合雜交種的棲息地。花椒果蠅主要在20 ~ 25℃活動，其食蚜活性隨氣溫升高而增加[31,32]。

奧地利很少有斑葉絳蟲的記錄，但最近有報道callipaeda的本地感染[33,34,35,36]。在本研究開始時，僅有的少量斑蠅記錄可追溯到1988年以前，目前尚不清楚這種果蠅在奧地利是否仍然是地方性的，如果是，分布有多廣[35,36]。

在奧地利布爾根蘭(Burgenland)發(fā)現(xiàn)斑葉蟲(P. variegata)的第一篇報道是最近才發(fā)表的[37]，該地區(qū)尚未對斑葉蟲及其載體P. variegata的遺傳多樣性進行調(diào)查。摘要本研究的目的是研究奧地利不同地區(qū)是否存在不同種類的斑葉瓢蟲和異葉瓢蟲，并評估它們的遺傳多樣性。在意大利與奧地利接壤的南蒂羅爾也調(diào)查了斑葉假蠅(P. variegata)和callipaeda的發(fā)生情況，以進一步了解這些種在意大利其他一些地區(qū)特有的物種的分布情況。

方法

樣品收集

勃林格殷格翰公司(奧地利維也納)數(shù)據(jù)庫中所有同意接收客戶郵件的獸醫(yī)都收到了一份調(diào)查問卷，旨在確定私人獸醫(yī)診所中記錄的callipaeda感染病例。該問卷可在2020年10月至11月期間在線完成。獸醫(yī)有可能將他們以前收集的或從隨后的臨床病例中收集的斑點絳蟲標本送到維也納獸醫(yī)大學寄生蟲學研究所。納入2015 - 年臨床病例資料，并納入已發(fā)表病例報告[34]。從以前去過國外的寵物身上收集的標本被排除在研究之外。

為了收集variegata，在森林、果樹和遛狗區(qū)附近設(shè)置了用一次性塑料瓶制作的捕蠅器，rogero等[27]對此進行了詳細描述。每2周從網(wǎng)中采集果蠅，在- 20°C冷凍以待分析，并更換切碎的水果作為誘餌。在2020年7月和8月，在四個地點的每個地點取樣了兩個陷阱。其中兩個地點位于已報告有callipaeda感染的地區(qū)(施蒂里亞州Deutschlandsberg鎮(zhèn)和下奧地利州G?nserndorf鎮(zhèn))，另外兩個地點是在獨立于已知病例的情況下選擇的(維也納Floridsdorf區(qū)和上奧地利州Rohr im Kremstal市)。2021年7月、8月和9月，在下奧地利州設(shè)置了18個陷阱，在上奧地利州設(shè)置了17個陷阱，在南蒂羅爾州設(shè)置了16個陷阱，在報告了callipaeda感染病例的參與獸醫(yī)診所以及其他志愿者提供的地點設(shè)置了11個陷阱(圖1)。

斑馬蟲采樣點的地理分布和受感染動物的居住地，如果沒有，本研究中包括的斑馬蟲臨床病例的治療獸醫(yī)的診所的地理分布。BL Burgenland, CA Carinthia, LA Lower Austria, SZ Salzburg, ST South Tyrol, SY Styria, TY Tyrol, UA Upper Austria, VI Vienna, VB Vorarlberg。[使用QGIS v.3.22.3 (Free Software Foundation, Boston, MA)創(chuàng)建的地圖]

此外，從一只狗的眼睛中收集了8只果蠅，并用網(wǎng)捕獲了3只果蠅。在與本研究同期進行的另一項研究[37]中發(fā)現(xiàn)的兩種斑葉假單胞蟲也被包括在內(nèi)。

所有樣本都在維也納獸醫(yī)大學寄生蟲學研究所或巴里大學獸醫(yī)系進行了形態(tài)鑒定。

DNA提取，PCR擴增，測序

采用QIAGEN公司的血液和組織試劑盒(QIAGEN, Hilden, Germany)，從斑葉假單胞菌(P. variegata)和callipaeda的整個標本中提取DNA。樣品在56°C下孵育過夜，并根據(jù)制造商的方案進行處理。為了篩選不同品種p.a variegata樣品中callipaeda DNA的存在，并對callipaeda樣品進行遺傳鑒定，分別使用引物COIintF/COIintR[38]和H14FilaCOIFw/H14FilaCOIRv[39]對線粒體COI片段649堿基對(bp)和674 bp片段進行pcr。利用引物Lep-F1/LepR1[40]和LCO1490/HCO2198[41]分別對COI基因665 bp和658 bp片段進行了DNA條形碼鑒定。利用引物UEA7/UEA10定位COI基因的不同區(qū)域，進一步分析了一份與P. variegata基因不同的Phortica樣品[42]。PCR產(chǎn)物在1.8%瓊脂糖凝膠中電泳，用Midori Green Advance DNA染色劑(Nippon Genetics Europe，德國)染色。PCR陽性樣本被送到一家商業(yè)公司(德國LGC Genomics)，使用PCR引物進行測序。

系統(tǒng)發(fā)育分析

為了進行系統(tǒng)發(fā)育分析，使用BLAST功能從GenBank (National Center For Biotechnology Information)和Barcode of Life Data System (BoldSystems)數(shù)據(jù)庫中獲取的核苷酸序列，對每個生物使用一個序列進行檢索。在GenBank中，將T. callipaeda序列指定為Thelazia (taxid 103826)，將P. variegata序列指定為Phortica (taxid 462262)，最大目標序列數(shù)設(shè)置為5000。對斑葉假單胞蟲(P. variegata)來說，只包括了屬于窄感假單胞蟲(Phortica sensu stricto)的物種。使用快速傅里葉變換(MAFFT) v.7.311[43]進行多重比對時，使用默認選項(FFT-NS-2)對序列進行比對和排序，排除未覆蓋本研究獲得的序列片段的序列。所有具有明顯測序錯誤和歧義特征的序列均從比對中剔除，排除在分析之外。

為了概述單倍型的多樣性，基于比對計算了每種生物的最大似然和貝葉斯推斷樹，包括T. callipaeda的110個序列(617個核苷酸位置)(附加文件1)和P. variegata的280個序列(647個核苷酸位置)(附加文件2)。使用分子生物學和進化(DAMBE) v.7.0.5.1的數(shù)據(jù)分析將這些序列分解為單倍型[44]。剩下42個單倍型和188個單倍型。以鼠Mastophorus muris序列(GenBank登錄號MK867476)和岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)序列(GenBank登錄號MG753768)作為異斑按蚊的外類群。最大似然bootstrap共識樹(1000個重復)使用W-IQ-TREE web服務器(http://iqtree.cibiv.univie.ac.at/;[45])，根據(jù)修正后的赤池信息準則，對模型檢驗中的數(shù)據(jù)集提出了最適合的擬合模型，分別為對檉柳的TIM2 F I G4和對花椒的TIM F I G4。貝葉斯推理樹的計算使用MrBayes v.3.2.7[46]，由于本程序中沒有相同的模型，因此使用下一個復雜模型GTR G I。分析運行了106代(鏈數(shù)，4)，每千棵樹采樣一次。前25%的樹作為老化樹被丟棄，根據(jù)剩余的7500棵樹計算50%的多數(shù)原則共識樹。

基于共識樹的結(jié)果，選擇進化支用于使用Network 10.2.0.0 (Fluxus Technology, Suffolk, UK)計算中位連接單倍型網(wǎng)絡(luò)，應用默認設(shè)置。網(wǎng)絡(luò)出版商v.2.1.2.3 (Fluxus Technology)以圖形方式編制了網(wǎng)絡(luò)，并向網(wǎng)絡(luò)提供了有關(guān)國家和主機的信息，最后由CorelDRAW 2021 (Corel，渥太華，安大略省)定稿。

目錄

結(jié)果

總共有183名獸醫(yī)填寫了問卷。其中，16名醫(yī)生表示他們檢測到了callipaeda，并指定宿主為布爾根蘭(n = 5)、下奧地利(n = 1)、薩爾茨堡(n = 1)、施蒂利亞(n = 5)和維也納(n = 1)的狗(n = 11)、貓(n = 2)和馬(n = 1)。在克恩頓州的一匹馬身上發(fā)現(xiàn)了callipaeda，這被認為是一種錯誤的鑒定，因為馬從未被報道為callipaeda的宿主，而是淚馬(Thelazia lacrymalis)的宿主[44,48]。年共采集6只犬標本12份。犬在診斷前未出過國，來自施蒂里亞州(n = 2)、下奧地利州(n = 1)、維也納(n = 1)和布爾根蘭(n = 2)(圖1)。

在調(diào)查的7個省中，有5個省檢測到斑竹(n = 45)(表1;圖1)捕蠅器捕獲32個標本;其中，17只雌性，8只雄性，7只身份不明(表1)。在布爾根蘭的一只2歲雄性杜賓犬的眼睛中發(fā)現(xiàn)了8只果蠅(圖1;表1)這只狗的兩只眼睛都有眼液，這是在2周前開始的。用含有莫西丁素(2.5 mg/kg BW)和吡蟲啉(10 mg/kg BW)的復方藥物治療。拜耳，勒沃庫森，德國)以及含有妥布霉素和地塞米松的外用軟膏(妥布霉素;諾華，巴塞爾，瑞士)。這只狗繼續(xù)表現(xiàn)出眼液，并在一周后出現(xiàn)在手術(shù)中。進一步檢查發(fā)現(xiàn)，兩只眼睛的結(jié)膜囊中都有死果蠅。用棉簽取蠅，眼液消失。

本研究獲得的序列上傳到BoldSystems(工藝標識為PAVEA165-22-PAVEA176-22、PAVEA183-22、PAVEA184-23-PAVEA227-23)和GenBank(登錄號為OP620892-OP620903、OQ507612、OQ359791-OQ359834和OQ689078)。

所有的T. callipaeda都對應于單倍型1，這是迄今為止在歐洲發(fā)現(xiàn)的唯一的單倍型(圖2)。在果蠅中，43個序列可分配給P. variegata，共有22個不同的單倍型。在從一只狗的眼睛中提取的一只果蠅的情況下，不可能獲得足夠質(zhì)量的序列，因此它被排除在系統(tǒng)發(fā)育分析之外。其中一個序列與P. variegata的序列不同，與以前在亞洲發(fā)現(xiàn)的物種(如Phortica chi和Phortica okadai)的序列更相似(圖3)。使用COI基因的不同區(qū)域?qū)υ摌颖具M行分析顯示，與一個P. okadai (GenBank登錄號EU431942)的相似性為99.67%，與另一個P. okadai (GenBank登錄號:EF576924)，與Phortica variegata和Phortica semivirgo的相似性分別為93.46%和92.32% (GenBank登錄號分別為MK659848和EF576935)。在所有植物標本中均未檢出callipaeda。

callipaeda細胞色素c氧化酶亞基I基因(COI)序列(617個核苷酸位置)的中位連接單倍型網(wǎng)絡(luò)顯示了地理分布(a)和報道的宿主(b)。圓圈代表單倍型;圓圈內(nèi)的數(shù)字代表個體數(shù)量;如果沒有數(shù)字顯示，則只表示一個人。圓形旁邊顯示了具有代表性的單倍型GenBank加入編號;白色圓圈表示中間節(jié)點;連接單倍型的分支上的條形圖表示替換的數(shù)量;星號表示本研究中獲得的個體的單倍型

與本研究未知標本(b)密切相關(guān)的Phortica variegata sensu stricto (a)和Phortica spp. COI序列(647個核苷酸位置)的中位連接單倍型網(wǎng)絡(luò)顯示了地理分布。圓圈代表單倍型;圓圈內(nèi)的數(shù)字代表個體數(shù)量;如果沒有數(shù)字顯示，則只表示一個人。圓形旁邊顯示了具有代表性的單倍型GenBank加入編號;白色圓圈表示中間節(jié)點;連接單倍型的分支上的條形圖表示替換的數(shù)量;星號表示本研究中獲得的個體的單倍型

討論

本研究在奧地利不同地區(qū)發(fā)現(xiàn)了callipaeda及其病媒斑葉蟲(P. variegata)。雖然以前在布爾根蘭、下奧地利、施蒂利亞和維也納都有報道[35,36,37]，但在上奧地利是首次發(fā)現(xiàn)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了異斑蝶和callipaeda分布的新區(qū)域，但由于奧地利并非所有省份都進行了采樣，并且誘捕器的位置是基于假定的宿主物種棲息地的適宜性，而不是根據(jù)系統(tǒng)的網(wǎng)格，因此無法無縫地繪制奧地利寄生蟲的存在和不存在。

雌斑田鼠主要在捕蠅器中捕獲，雄斑田鼠主要在犬眼周圍捕獲。雄性斑田鼠對眼睛的偏好并不意外，這在其他研究中也有觀察到，并且只有雄性斑田鼠被認為是callipaeda的載體[25,27,49]。據(jù)我們所知，到目前為止，還沒有報道過狗結(jié)膜囊中有斑斑偽蠅引起的臨床癥狀。這可能是獲得的果蠅在進食淚液時被捕獲在眼睛里。

正如預期的那樣，在奧地利只發(fā)現(xiàn)了T. callipaeda單倍型1，這是迄今為止在歐洲檢測到的唯一單倍型。相比之下，亞洲有很高的單倍型多樣性[21,50]。據(jù)推測，T. callipaeda不是原產(chǎn)于歐洲，它傳入歐洲是一個單一的事件。這一假設(shè)也得到了以下事實的支持:1989年意大利首次報道了T. callipaeda，之后由于P. variegata作為中間宿主的存在，它傳播到其他歐洲國家[25,51,52,53]。

在歐洲和亞洲，雖然在歐洲也有一些野生動物被報道為宿主，但在狗身上常見于犬類。自從首次報道這種寄生蟲在歐洲出現(xiàn)以來，人們對它的興趣增加了，有關(guān)它在新宿主中出現(xiàn)的報道可能部分是由于研究工作的增加。最近的報告表明，亞洲的野生動物很可能也經(jīng)常被感染[10,11]。盡管在歐洲有人類感染T. callipaeda的病例報告，但這些病例在亞洲更為常見。歐洲動物的感染率可能還沒有高到足以導致許多人類病例。然而，如果這種寄生蟲在歐洲變得更加普遍，這種情況將來可能會改變[3,18]。由于本研究中報告的臨床病例數(shù)較少，以及調(diào)查的Phortica果蠅均未檢測出該寄生蟲，因此奧地利目前的callipaeda流行率可能較低。

在COI條形碼區(qū)，許多種在P. variegata復合體中不是單系的。然而，在先前的研究[54]和本研究中，P. variegata sensu stricto都被證明是單系的。在美國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了2個單倍型，在歐洲發(fā)現(xiàn)了23個不同的單倍型，其中本研究發(fā)現(xiàn)了20個新單倍型。在奧地利發(fā)現(xiàn)的單倍型的多樣性可歸因于這種果蠅長期以來一直是歐洲本土[35]。

與斑葉假蠅不同的COI條形碼序列與歐洲尚未報道的chi和okadai假蠅的COI條形碼序列更為接近。后兩個物種不是單系的，也不是與它們密切相關(guān)的形態(tài)種或隱種明顯分開的，因此通過使用COI基因來描述它們是有限的[54,55]。Phortica chi和P. okadai僅在亞洲報道，但P. semivirgo是P. variegata復合體的另一種，在歐洲被發(fā)現(xiàn)[29,56,57]。由于在分析時沒有COI條形碼區(qū)域的參考序列，因此對COI基因的另一個區(qū)域進行了額外的分析，以確定樣品是否可能來自半處女草標本。雖然該序列與報道的P. okadai序列(GenBank登錄號EU431942)相似度為99.67%，但與報道的P. semivirgo序列(GenBank登錄號EF576935)不密切相關(guān)，與比較歐洲Phortica種的系統(tǒng)發(fā)育研究中使用的P. okadai序列(GenBank登錄號EF576924)相似度僅為92.16%[29]。

補充信息

AdditioNal文件1:

線粒體細胞色素c氧化酶亞基I基因(COI)的貝葉斯干擾樹(BI);節(jié)點用BI后驗概率和最大似然自舉值標記。用紅色標記的分支用于計算包含本研究中獲得的序列的中位連接單倍型(hpt)網(wǎng)絡(luò)。比例尺表示根據(jù)所采用的序列進化模型，期望每個位點的平均替換數(shù)。

AdditioNal文件2:

以Phortica senu stricto的COI(647個核苷酸位置)序列為特征的BI樹。節(jié)點用BI后驗概率和最大似然自舉值標記。用紅色標記的分支用于計算包含本研究中獲得的序列的中位連接hpt網(wǎng)絡(luò)。比例尺表示根據(jù)所采用的序列進化模型，期望每個位點的平均替換數(shù)。

結(jié)論

需要利用額外的遺傳標記對Phortica spp.進行進一步分析，以闡明本研究中發(fā)現(xiàn)的新序列的意義，并評估其在歐洲其他地區(qū)的發(fā)生情況。callipaeda及其媒介斑葉蟲(P. variegata)可被認為是奧地利的地方病。